Inmunoensayos (I): precipitación y aglutinación
Como ya se mencionó en post anteriores, muchas enfermedades pueden ser diagnosticadas mediante reacciones antígeno- anticuerpo realizadas in vitro. Sin embargo; es necesario disponer de un método que permita visualizar dicha reacción.
Para evidenciar la reacción antígeno- anticuerpo algunas pruebas de laboratorio hacen uso de las propiedades que tiene los complejos inmunes o inmunocomplejos; otras, utilizan anticuerpos conjugados a enzimas, fluorocromos o isótopos radiactivos y otras tantas se fundamentan en la neutralización de una actividad biológica del antígeno, sobre todo cuando la actividad biológica del antígeno puede medirse.
La elección del método de detección va a depender de una serie de factores entre ellos características de las moléculas involucradas y su concentración, si se trata de una molécula soluble o está presente en la superficie de una célula, el grado de pureza de los reactivos, el equipamiento del que se disponga, los costos, la experiencia, etc.
En los próximos post describiré este vasto grupo de pruebas e comenzaré con las pruebas que utilizan como método de detección las propiedades de los complejos inmunes.
Los inmunoensayos de precipitación y aglutinación son pruebas de fácil ejecución y muy económicas
Cuando el antígeno es soluble el complejo inmunológico puede ponerse en evidencia mediante la formación de un precipitado, las pruebas que utilizan esta estrategia de detección se conocen como pruebas o reacciones de precipitación. Por su parte, en las pruebas o reacciones de aglutinación la reacción antígeno- anticuerpo se visualiza mediante la formación de un agregado o grumo. A diferencia de las pruebas de precipitación, las pruebas de aglutinación requieren que el antígeno se encuentre unido a una célula (bacteria o eritrocito) o a una partícula inerte; en otras palabras se requiere que el antígeno sea insoluble.
Tanto en las pruebas de precipitación como en las de aglutinación es necesario que: a) el antígeno y el anticuerpo se encuentren en concentraciones elevadas ya que su sensibilidad está en el orden de los microgramos, b) el antígeno debe ser multivalente; es decir debe poseer al menos, dos determinantes antigénicos idénticos y c) están afectadas por fenómenos zonales y por ello la reacción antígeno- anticuerpo sólo ocurre si ambos elementos están presentes en proporciones óptimas, es decir no debe haber más antígeno que anticuerpo ni más anticuerpo que antígeno (Figura 1). El exceso de uno de los dos elementos con respecto al otro inhibe la reacción, lo cual puede resultar en un falso negativo. En consecuencia es indispensable que toda muestra que resulte negativa sea diluida y vuelta a ensayar.
Figura 1. Fenómenos zonales y mecanismo de reacción. Durante las reacciones de precipitación y de aglutinación se forman enrejados; dichos enrejados sólo ocurren cuando las cantidades relativas de antígeno y de anticuerpo son óptimas. Bajo condiciones de exceso de antígeno o de anticuerpos no se forman enrejados extensos y la reacción se inhibe. Observe que cuando uno de los dos elementos se encuentra en exceso (como en los tubos 1, 2 , 7 y 8) la reacción no ocurre. Ac= anticuerpo, Ag= antígeno. Ac= anticuerpo, Ag= antígeno
Las reacciones de precipitación dan lugar a la formación de un precipitado
Los inmunoensayos de precipitación pueden realizarse en medio líquido o en geles. Un ejemplo de reacción de precipitación en medio líquido lo representa la nefelometría en la cual se mide la dispersión de un rayo de luz que causan los inmunocomplejos cuando dicho rayo se hacen pasar a través de un tubo o recipiente que contiene el antígeno y el anticuerpo. La luz dispersada es detectada por el nefelómetro y resulta ser proporcional a la cantidad de inmunocomplejos formados. Esta técnica es útil para cuantificar inmunoglobulinas de las clases IgG, IgM e IgA e incluso algunas subclases de IgG. También puede cuantificarse proteínas del complemento como C3, C4 o el inhibidor de C1 y proteínas séricas como albúmina, proteína C reactiva, anticuerpos anti-estreptolisina O y factor reumatoide.
Otro ejemplo de reacciones de precipitación en medio líquido lo representan las reacciones de floculación entre las que destaca la prueba de VDRL (del inglés, Venereal Research Disease Laboratory) en la cual se hace reaccionar el suero del paciente, quien presuntamente tiene sífilis, con una suspensión que contiene cardiolipina, lecitina y colesterol. Si el suero del paciente contiene los anticuerpos se formará un flóculo que puede visualizarse usando el microscopio óptico (Figura 2). La prueba de VDRL aunque sencilla y económica, utiliza un antígeno ampliamente distribuido (un antígeno heterogenético); esto trae como consecuencia muchos resultados falsos positivos; por ello los resultados positivos deben confirmarse mediante pruebas que utilizan antígenos obtenidos del agente responsable de la sífilis y por ende más específicas.
La prueba de inmunodifusión radial de Mancini es una prueba basada en la formación de precipitados en gel o medio semisólido y se utiliza para cuantificar antígenos en suero u otros líquidos corporales (Figura 3). Para ello la muestra que presuntamente contiene el antígeno que se investiga se deposita en un pocillo central desde donde difunde radialmente, atravesando un gel que contiene anticuerpos específicos para el antígeno. Después de un período de incubación adecuado, los inmunocomplejos precipitan alrededor del pocillo formando un anillo cuyo tamaño es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra.
Figura 3. Inmunodifusión radial de Mancini. El gel (preparado usando agarosa) contiene el anticuerpo específico para el antígeno que se desea evaluar; en la medida que el antígeno difunde a través del gel interactúa con el anticuerpo formado anillos de precipitación cuyo tamaño es proporcional a la concentración del antígeno presente en la muestra. Si junto con la mezcla se incuban soluciones de concentración conocida puede estimarse la concentración del antígeno en la muestra
La prueba de inmunodifusión doble de Ouchterlony, también es un ejemplo de prueba de inmunodifusión en gel; sin embargo, en este caso el gel no contiene ni anticuerpos ni antígenos y los elementos de la reacción se colocan en dos pocillos situados a cierta distancia (Figura 4). Ambos elementos de la reacción, difunden a través del gel dando lugar a una línea o banda de precipitación en el lugar donde ambos elementos se encuentren en proporciones óptimas.
Figura 4. Prueba de inmunodifusión doble de Ouchterlony. Una vez que el gel ha solidificado se realizan dos orificios, en uno de ellos se coloca el antígeno y en el otro se coloca el anticuerpo o el suero que presuntamente contiene el anticuerpo. Al concluir el período de incubación, se observará una línea o banda de precipitación entre ambos pozos
En las reacciones de aglutinación se forman grumos visibles a simple vista
Las reacciones de aglutinación se fundamentan en la formación de agregados o grumos que se visualizan a simple vista cuando se mezclan antígenos insolubles (aglutinógenos) con sus correspondientes anticuerpos (aglutininas). Los aglutinógenos más frecuentemente utilizados en este tipo de reacciones son suspensiones bacterianas, partículas inertes tales como látex, poliestireno, bentonita, entre otras sobre las cuales se han acoplado antígenos solubles.
Este tipo de pruebas son útiles para detectar anticuerpos o antígenos, pueden realizar en forma cualitativa o semicuantitativa y aunque no pueden realizarse en forma cuantitativas, la facilidad con que se ejecutan, la posibilidad de obtener resultados en pocos minutos y su elevada sensibilidad analítica las hacen muy útiles en el inmunodiagnóstico.
En aquellas reacciones donde no se produce aglutinación las partículas se mantienen en una suspensión homogénea, mientras que en las reacciones donde se produce la aglutinación de las partículas, éstas formarán grumos macroscópicamente visibles (Figura 5). La interpretación del resultado (positivo o negativo) dependerá de la modalidad de la prueba de aglutinación que se realiza.
Figura 5. Reacciones de aglutinación. La reacción antígeno-anticuerpo se visualiza gracias a la formación de un agregado (o grumo) visible a simple vista (izquierda). La ausencia de grumos (derecha) indica que la reacción no ocurrió. La interpretación del resultado (positivo o negativo) dependerá de la modalidad de la prueba de aglutinación (Laboratorio de Inmunología, Departamento de Microbiología, FCS-Sede Aragua, Universidad de Carabobo)
La aglutinación de eritrocitos se conoce como hemaglutinación, estas pruebas se llevan a cabo en tubos o microplacas de titulación. Una aplicación de las pruebas de hemaglutinación lo representa la tipificación de grupo sanguíneo y la determinación de factor Rh, en la cual se hace reaccionar los eritrocitos del paciente con antisueros específicos.
Es importante considerar que la capacidad aglutinante de la IgM es mayor que la de los anticuerpos de clase IgG. Esto está relacionado con la estructura de ambas clases de inmunoglobulina, los anticuerpos de clase IgG poseen dos lugares de unión con el antígeno (es un monómero) mientras que los anticuerpos de clase IgM poseen, al menos en teoría, diez lugares de unión (es un pentámero). Esta cualidad y la flexibilidad de su región bisagra permiten a los anticuerpos de clase IgM interactuar con epítopes que se encuentran separados en la superficie celular y con ello favorecer la aglutinación. Debido a su menor capacidad aglutinante, los anticuerpos de clase IgG no provocan la aglutinación de los eritrocitos; no obstante, esto puede resolverse si se utiliza un segundo anticuerpo que reacciona con los epítopes presentes en el Fc de la IgG. Este anticuerpo secundario o antiglobulina se conoce como reactivo de Coombs y su uso es la base de las pruebas de Coombs que se emplean rutinariamente para demostrar la presencia de anticuerpos contra eritrocitos en el diagnóstico de las anemias hemolíticas auto e isoinmunes.
Por otra parte, el diagnóstico de diversas infecciones bacterianas como leptospirosis, salmonelosis y brucelosis puede llevarse a cabo mediante la reacción del suero del paciente con suspensiones bacterianas, si los anticuerpos específicos contra la bacteria están presentes en el suero del paciente, se formarán grumos visibles a simple vista, producto de la reacción antígeno- anticuerpo.
Además de eritrocitos y suspensiones bacterianas las pruebas de aglutinación utilizan antígenos o anticuerpos adsorbidos (o acoplados) a partículas de látex. Las partículas de látex que tienen acoplados antígenos (o anticuerpos) pueden aglutinar gracias a la interacción con anticuerpos (o antígenos) presentes en la muestra biológica que se investiga. Por ejemplo, los pacientes con artritis reumatoide elaboran anticuerpos que reaccionan con el Fc de la IgG, estos anticuerpos (llamados factores reumatoides) aglutinan partículas de látex a las cuales se ha acoplado IgG. La aglutinación de partículas de látex también se utiliza para identificar anticuerpos anti-estreptolisina O lo cual resulta útil en el diagnóstico de infecciones causadas por estreptococos beta-hemolíticos. En este caso, las partículas de látex tienen estreptolisina O adsorbida a su superficie y aglutinan si la muestra que se evalúa posee los anticuerpos contra la estreptolisina O. Durante el curso de un proceso inflamatorio por cualquier etiología se produce proteína C reactiva, ésta puede identificarse y cuantificarse mediante la aglutinación de partículas de látex a las cuales se han absorbido anticuerpos anti-proteína C reactiva.
Otras pruebas de aglutinación utilizan eritrocitos (generalmente, de carnero) como transportadores de antígenos microbianos. Es el caso de las pruebas utilizadas para determinar anticuerpos contra los protozoarios Toxoplasma gondii y Trypanosoma cruzi (Figura 6), los anticuerpos presentes en el suero que se analiza ocasionan la aglutinación de los eritrocitos portadores del antígeno; los eritrocitos aglutinados sedimentan formando un manto o tapiz en el fondo del pocillo de una placa de microaglutinación.
Figura 6. Prueba de hemaglutinación para determinar anticuerpos específicos contra un patógeno. Los antígenos de microorganismos (como Toxoplasma gondii o Trypanosoma cruzi) pueden acoplarse a glóbulos rojos de carnero; éstos se hacen reaccionar con el suero del paciente, los anticuerpos contra los antígenos del parásito, provocarán la aglutinación de los eritrocitos, los cuales se depositarán en el fondo del pocillo formando un manto o tapiz (pozos 4 al 8); la ausencia de anticuerpos se evidencia mediante la formación de un anillo en el fondo del pocillo (pozos 9 al 12) (Laboratorio de Inmunología, Departamento de Microbiología, FCS-Sede Aragua, Universidad de Carabobo)
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