Inmunoensayos

Las alteraciones del sistema inmunitario tales como infecciones, inmunodeficiencias, enfermedades autoinmunes, procesos alérgicos o tumorales pueden ser diagnosticadas mediante diferentes pruebas de laboratorio que permiten identificar, cuantificar y evaluar la funcionalidad de los diferentes componentes del sistema inmunitario. 

Las pruebas empleadas en los laboratorios clínicos han evolucionado con el avance y el desarrollo tecnológico; sin embargo, el uso de antígenos y anticuerpos constituye una de las técnicas más sensibles, específicas y económicas. 

Los inmunoensayos emplean anticuerpos o antígenos y se fundamentan en la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo

Los anticuerpos además de ser un producto de la respuesta inmunitaria, han resultado ser una excelente herramienta en el diagnóstico y tratamiento de diferentes patologías; su extraordinaria especificidad ha conducido al desarrollo de diferentes pruebas que permiten detectar y cuantificar tanto anticuerpos como antígenos. 

Los inmunoensayos son de gran utilidad en la práctica médica ya que gracias a este grupo de pruebas puede establecerse el diagnóstico de diferentes enfermedades, al medir el grado de la respuesta inmunitaria o identificar moléculas de interés clínico. A manera de ejemplo puede mencionarse las pruebas utilizadas para determinar anticuerpos específicos contra un patógeno (Ej., virus de inmunodeficiencia humana, VIH) o aquellas utilizadas para medir hormonas y drogas o para estudiar subpoblaciones de linfocitos y hacer diagnóstico de enfermedades de origen hemático como las leucemias.

Las pruebas de laboratorio pueden clasificarse según la forma en que se reportan los resultados

En cualquier caso los inmunoensayos utilizan una reacción antígeno-anticuerpo para llevar a cabo la determinación; estas pruebas, al igual que otras pruebas de laboratorio, pueden ser cualitativas, cuantitativas o semicuantitativas. 

Las pruebas de laboratorio que sólo permiten demostrar o detectar un antígeno o un anticuerpo se conocen como pruebas cualitativas y el resultado se informa en términos de “POSITIVO” si el elemento que se investiga puede ser demostrado en la muestra biológica o por el contrario si el elemento que se investiga no fue detectado el resultado se considera “NEGATIVO”. Un ejemplo de este tipo de pruebas es la detección de gonadotropina coriónica humana (GCh) en sangre u orina, prueba ampliamente utilizada para el diagnóstico precoz del embarazo (Figura 1). 

Figura 1. Pruebas cualitativas. En las pruebas cualitativas sólo hay dos posibles resultados: positivo (A) o negativo (B) I.- inmuensayo enzimático en fase solida, II.-pruebas de aglutinación, III.- hemaglutinación, IV.- enayo inmunoenzimático (ELISA)

En ocasiones no basta con saber si el elemento de interés está presente o no en una muestra biológica, sino que es necesario conocer su cantidad o concentración. En ese caso debemos realizar una prueba cuantitativa; para determinar la cantidad absoluta del elemento que se está investigando y el resultado se reporta utilizando unidades de concentración. La determinación de la concentración de IgG o de algunos componentes del sistema de complemento como C3 o C4 son ejemplos de este tipo de determinaciones.

En el laboratorio de inmunología existe una serie de pruebas llamadas pruebas semicuantitativas, cuyo propósito es determinar la cantidad relativa del elemento que se investiga y el resultado se expresa utilizando el término título, el cual corresponde a la dilución más alta donde se obtiene una reacción positiva y hace referencia a cuántas partes de la muestra contienen una parte del elemento que se investiga (Figura 2). Por ejemplo, en la determinación semicuantitativa de proteína C reactiva, el título obtenido para una muestra sérica fue 1/32; esto significa que la prueba demostró una parte de proteína C reactiva en 32 partes de la muestra. Si se conoce la sensibilidad de la prueba podemos calcular la concentración relativa del elemento que estamos investigando. En ejemplo anterior supongamos que la sensibilidad de la determinación es 0,8 mg/dL, así la concentración relativa corresponderá al producto de la sensibilidad por el inverso del título (en el ejemplo sería 25,6 mg/dL).

Figura 2: Determinación semicuantitativa. Para realizar una determinación semicuantitativa debemos hacer diluciones seriadas de la muestra en estudio y posteriormente evaluar cada una de las diluciones mediante la prueba en cuestión. El título corresponderá a la mayor dilución del suero donde se obtenga un resultado positivo. En el ejemplo el título de la determinación es 1/32 

Los inmunoensayos usan antígenos o antisueros de referencia

Para el desarrollo de un inmunoensayo el suero del paciente es enfrentado a un antígeno de referencia, que se trata de un extracto derivado del patógeno que se investiga, proteínas purificadas o incluso proteínas recombinantes. Pero en otros casos, se mezcla el suero del paciente con antisueros conocidos o de referencia (recordemos que un antisuero es un producto biológico que contiene el conjunto de anticuerpos producidos por el sistema inmunitario luego de la administración de un inmunógeno). Estos antisueros de referencia pueden ser monovalentes, polivalentes o hiperinmunes.  

Los antisueros monovalentes son el resultado de la inoculación de un animal con una sola especie de microorganismo o una sola toxina (es decir un único inmunógeno). Los antisueros polivalentes resultan de la inoculación de un animal con dos o más antígenos (varias especies de microorganismos o varias toxinas). Cuando un antisuero contiene un alto título de anticuerpos, se le denomina suero hiperinmune; este tipo de sueros son el resultado de inocular en forma repetida el (los) inmunógeno(s) de interés a un animal. 

Las pruebas de laboratorio tienen diferente exactitud y precisión

Las diferentes pruebas que se realizan en un laboratorio pueden describirse usando los términos precisión y exactitud (Figura 3). El término precisión es sinónimo de reproducibilidad o repetibilidad de la prueba. La precisión es el grado de coincidencia entre los resultados de análisis repetidos, llevados a cabo sobre una misma muestra, independientemente del verdadero valor. Cuanto menores sean las diferencias entre los resultados obtenidos en ensayos repetidos, mayor será la precisión. 

Figura 3. Precisión y exactitud. Cuando se lanza un dardo a una diana puede presentarse tres situaciones; los dardos podrían dar siempre en el centro de la diana (A), podrían caer fuera del centro de la diana pero siempre en el mismo lugar (B) o caer en un lugar diferente cada vez que se lanza el dardo (C). En el primer caso el lanzador es preciso y exacto, en el segundo caso el lanzador tiene precisión pero no exactitud y en el tercer caso el lanzador no es ni preciso ni exacto

Por otra parte, la exactitud se basa en cuánto se aproximan los resultados obtenidos al valor real del elemento que se investiga presente en una muestra biológica. Cuanto menor sea la diferencia entre el valor obtenido para el elemento que se investiga y su verdadero valor, mayor será la exactitud del método utilizado para medirlo. Lo ideal es que toda prueba de laboratorio sea precisa y exacta; sin embargo, algunas pruebas de laboratorio pueden ser precisas pero no exactas.

Conocer la precisión y exactitud de una prueba de laboratorio no es suficiente para interpretar los resultados

Ahora bien, la interpretación de los resultados obtenidos al momento de realizar una prueba de laboratorio deben ser interpretados no sólo con base a la exactitud y precisión de la prueba, sino también tomando en cuenta la sensibilidad diagnóstica, especificidad diagnóstica y los valores predictivos de la prueba empleada para la determinación, esto evitará que se tomen decisiones equivocadas que podrían perjudicar al paciente. 

Para determinar la sensibilidad, especificidad y los valores predictivos de una prueba de laboratorio, es necesario comparar los resultados obtenidos para dicha prueba con aquellos obtenidos mediante una prueba de referencia. Ambas pruebas deben realizarse a individuos con la condición normal (libres de la patología o libres de la infección) y a individuos que poseen la condición patología o una infección confirmada. Para cada individuo participante se anotan dos tipos de información: 1) resultado del diagnóstico de referencia (normal o patológico) y 2) resultado de la prueba (positiva o negativa). Esto permite dividir los resultados en cuatro categorías: verdaderos positivos (VP), verdaderos negativos (VN), falsos positivos (FP) y falsos negativos (FN). Por supuesto los resultados FP y FN no son deseables y llevan al clínico a tomar decisiones equivocadas. Los resultados se pueden recoger en una tabla de contingencia 2x2 como la que se muestra en el cuadro 1. 

Cuadro 1. Durante la evaluación de una prueba de laboratorio los resultados se recogen en una tabla de contingencia 2x2. (VP=verdaderos positivos, VN=verdaderos negativos, FP=falsos positivos, FN= falsos negativos)

*Diagnóstico de referencia: cualquier otro método ampliamente utilizado para el diagnóstico de la patología o la investigación que se investiga y considerada como prueba de oro. Entre ellas  pruebas de laboratorio como cultivos, frotis, examen al fresco, etc, estudios de imagenología, biopsia, etc.

La sensibilidad diagnóstica (la cual, no debe ser confundida con la sensibilidad analítica o capacidad de una prueba para detectar muy bajas concentraciones de una sustancia que se investiga en una muestra biológica) se define como la capacidad de una prueba para detectar a los individuos que padecen de la condición patológica y que tienen pruebas positivas; es decir corresponde a la capacidad de la prueba de identificar correctamente a los individuos enfermos o infectados.

Por el contrario, la especificidad diagnóstica corresponde a la fracción de individuos libres de la condición patológica (o sin infección) que tienen pruebas negativas; en otras palabras, es la capacidad de una prueba para detectar a los individuos verdaderos negativos. 

Los valores de predicción de una prueba son una estimación sobre la probabilidad de que exista la patología considerando el resultado de la prueba. Así, el valor de predicción negativo corresponde a la fracción de pruebas negativas que representa la ausencia de la patología; en otras palabras, es la probabilidad de que una prueba negativa represente la ausencia de la enfermedad. Por su parte, el valor de predicción positivo corresponde a la probabilidad de que una prueba positiva represente la existencia de la patología o infección. 

Con el propósito de ilustrar lo señalado anteriormente, supongamos que se desea evaluar un inmunoensayo para detectar antígenos de la nucleocápside del virus SARS-CoV.  Para ello se escogieron 72 personas con síntomas de infección por SARS-CoV y con prueba de PCR (PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction considerada como prueba de referencia) positivo. En el estudio se incluyen 112 personas sanas, las cuales no presentan signos o síntomas de infección y con PCR negativo. Al concluir el estudio se encontró que de las 72 personas con síntomas y PCR positivo, 23 resultaron negativas a la nueva prueba y de las 112 personas asintomáticas y PCR negativo, 109 resultaron positivas al inmunoensayo. Los resultados se recogieron en una tabla de contingencia 2x2 y se calculó la sensibilidad, la especificidad y los valores de predicción usando las expresiones matemáticas adecuadas (Figura 4). 

Figura 4. Determinación de la sensibilidad, especificidad y los valores de predicción para inmunoensayo. Los datos presentados son hipotéticos y sirven para ejemplificar los cálculos e interpretación de los conceptos explicados en el texto

Ahora veamos qué nos dicen los resultados. Como vemos la sensibilidad del nuevo inmunoensayo es menor que la especificidad y por lo tanto la capacidad de la prueba de identificar a los individuos infectados es menor que su capacidad para identificar a los no infectados; en consecuencia, un resultado positivo indica o confirma el diagnóstico de infección por el virus pero un resultado negativo no descarta la ausencia de infección. 

En relación con los valores de predicción podemos afirmar que la probabilidad de que el nuevo inmunoensayo resulte positivo cuando la muestra realmente es positiva (verdadero positivo) es alta (valor de predicción positivo=94,2%); por lo tanto un resultado positivo asegura con una elevada probabilidad que la persona está infectada, mientras que el resultado obtenido para el valor de predicción negativa de 82,3% y nos indica que un resultado negativo no excluye la infección. 

En este caso podemos concluir que los resultados falsos negativos son más probables que los falsos positivos. Por ello los resultados negativos obtenidos con esta prueba deberían considerarse dudosos y por lo tanto deben ser verificados mediante otra prueba, los datos clínico-epidemiológicos o la prueba debe repetirse unos días más tarde.