Evaluación del sistema de complemento

Existen diferentes pruebas de laboratorio que permiten valorar los trastornos en la función del sistema de complemento; en esta ocasión describiré las pruebas que permiten evaluar la funcionalidad de la vía clásica y la vía alternativa del complemento.

Prueba del complemento hemolítico total CH50

El análisis cuantitativo de la actividad hemolítica del complemento o prueba de complemento hemolítico total CH50 es una prueba funcional que refleja la actividad de los componentes de la vía clásica del sistema de complemento; por lo tanto, permite conocer la integridad funcional del sistema de complemento.

Esta prueba se fundamenta en la capacidad de los diferentes componentes de la vía clásica del sistema de complemento de causar la lisis de eritrocitos de carnero (GCR) sensibilizados con anticuerpos anti-eritrocito o también llamados hemolisinas (anti-GCR).

Para llevar a cabo esta prueba, se dispone de una batería de tubos, a la cual se  añade cantidades variables y crecientes del suero en estudio diluido, a cantidades fijas del sistema indicador, el cual está conformado por eritrocitos de carnero y anticuerpos antieritrocitos (o hemolisinas). Luego, se incuba bajo condiciones adecuadas y finalmente se determina la cantidad de hemoglobina liberada o grado de hemólisis con ayuda de un espectrofotómetro (Figura 1).

Figura 1. Prueba del complemento hemolítico total CH50. La activación de los componentes de la vía clásica del sistema de complemento presentes en el suero provoca la lisis de los eritrocitos de carnero (GRC) sensibilizados con anticuerpos antieritrocitos (anti-GRC) también llamados hemolisinas, liberando hemoglobina; ésta se cuantifica espectrofotométricamente (540 nm). Los datos obtenidos permiten construir una curva dosis-respuesta con la cual se estima las unidades hemolíticas CH50 presentes en el suero del paciente

El grado de hemólisis y la cantidad de suero añadido se relacionan mediante la ecuación de Von Krogh; la cual permite determinar las unidades hemolíticas CH50 presentes en el suero en estudio. Una unidad hemolítica CH50 corresponde con la cantidad de suero del paciente que ocasiona la hemólisis de 50% de los eritrocitos de carnero.

Las personas con deficiencias congénitas de uno o más de los componentes de la vía clásica del complemento muestran títulos CH50 bajos. No obstante, en las inmunodeficiencias secundarias, la disminución de un componente en particular, a la mitad o menos de la mitad de su concentración normal tienen poco efecto sobre el resultado de esta prueba ya que los ensayos funcionales como la prueba del complemento hemolítico total CH50 reflejan únicamente cambios importantes de los valores o de la actividad de las proteínas del complemento. En estos casos resulta más conveniente cuantificar proteínas del complemento; particularmente C3, C4 e inhibidor de C1, mediante inmunodifusión radial de Mancini, nefelometría, ELISA o RIA.

Prueba de la vía alterna hemolítica (VA-CH50)

Esta prueba se basa en la propiedad que presentan los glóbulos rojos de conejo para activar la vía alternativa del sistema de complemento. Este fenómeno parece depender de un componente presente en la membrana plasmática de este tipo de eritrocitos. 

En este caso se incuban glóbulos rojos de conejo con cantidades variables y crecientes del suero del paciente previamente tratado con agentes quelantes de calcio tales como el EGTA (ácido etilén-glicol- bis β aminotetra-acético) y concentraciones apropiadas de Mg++. El EGTA secuestra el Ca++, lo cual desestabiliza el C1 y con ello inactiva la vía clásica del sistema de complemento. 

Posteriormente, se determina el grado de hemólisis y se establece el 50% como punto final según la ecuación de Von Krogh, expresando los resultados en unidades R-CH50.

En casos clínicos seleccionados resulta útil valorar la actividad de uno de los componentes del complemento, en forma individual; tal es el caso de la prueba actividad hemolítica del factor B. Para ello, se incuba cantidades variables y crecientes del suero en estudio con glóbulos rojos de conejo y una cantidad estandarizada de un suero de referencia carente de factor B. Para obtener el suero de referencia deficiente en factor B se toma una muestra de suero normal y se calienta durante 20 minutos a 50ºC. 

Durante el desarrollo de la prueba, la activación de la vía clásica del sistema de complemento se previene mediante el secuestro del Ca++ con EGTA y la vía alterna se facilita enriqueciendo el medio de la reacción con Mg++ y por la presencia de eritrocitos de conejo que son activadores de la vía alterna y que sirven como reveladores. Si el suero en estudio presenta concentraciones bajas del factor B, la hemólisis de los eritrocitos será deficiente y en consecuencia el porcentaje de hemólisis será bajo.

Ecuación de Von Krogh

La relación entre la hemólisis y la cantidad de suero (complemento) añadido sigue una curva sigmoidal (Figura 2) y en su parte central corresponde a la cantidad de suero que ocasiona el 50% de hemólisis de los eritrocitos presentes en el sistema (una unidad hemolítica CH50). La expresión matemática de dicha curva corresponde con la ecuación de Von Krogh.

Figura 2. Expresión matemática de la ecuación de Von Krogh. La relación entre la cantidad de suero añadido y el porcentaje de hemólisis sigue una curva sigmoidal, la relación entre ambas variables es casi lineal en el punto alrededor del 50% y es por ello que se usa la parte central de la curva para hacer los cálculos necesarios a fin de obtener el valor de una unidad hemolítica CH50

Sin embargo, el análisis de los resultados se simplifica si la ecuación de Von Krogh se transforma en la ecuación de una recta; esto puede lograrse fácilmente llevando a cabo una transformación logarítmica (Figura 3). Esta operación matemática ofrece una fórmula que resulta útil para la valoración del complemento, ya que su representación gráfica es una recta y por lo tanto se requieren pocos puntos para su trazado y se cometen menos errores al hacer la interpolación. 

Figura 3. Representación gráfica de la ecuación de Von Krogh luego de la transformación logarítmica. Cuando y es igual a 50% (ó ½), la expresión (y/1-y) es igual a 1; entonces el log x es igual al log K (log x =log K) lo que  se corresponde con la cantidad de suero que provoca el 50% de hemólisis. 

Por lo tanto, graficando los valores de log x en función al log (y/1-y), el punto donde el valor de log (y/1-y) vale cero, se corresponde con la cantidad de suero que ocasiona la hemólisis del 50% de los eritrocitos del sistema; en otras palabras, ese valor corresponde a una unidad hemolítica CH50. 

Con frecuencia, patologías como  enfermedades infecciosas de diferente etiología, enfermedades alérgicas o enfermedades por complejos inmunológicos se asocian con alteraciones del complemento, las cuales conducen a una disminución o, menos frecuente a un aumento en la concentración del complemento. También, se han descrito deficiencias congénitas del completo o alteraciones primarias que conducen a déficit  (concentraciones bajas o ausentes) o disfunción (alteraciones estructurales del componente que llevan a fallas en la función) de uno o varios componentes del sistema de complemento. Las pruebas descritas anteriormente son de gran importancia en la clínica ya que contribuyen a hacer el diagnóstico.